Dr. Josephine Meibom - PhD Defense - September 3rd, 2026

Enteric viruses are important contaminants of surface waters and are a significant burden on public health. Because these viruses cannot replicate outside their natural hosts, their ability to spread depends largely on their environmental stability. In aquatic ecosystems, enteric viruses are exposed to a range of abiotic and biotic stressors which can exert either inactivating or protective effects. These factors differentially impact virus types, resulting in variability in the stability of viral pathogens. Aquatic microbial communities have demonstrated antiviral activity through the action of secreted proteases. These enzymes hydrolyze peptide bonds and mediate virus inactivation through degradation of the virus capsid. In this thesis, I investigated the mechanisms of microbial inactivation of enteric viruses in lakewater, specifically the antiviral activity of microbial extracellular proteases.

We first characterized the substrate specificity of the extracellular proteases present in Lake Geneva, Switzerland. Using Multiplex Substrate Profiling by Mass Spectrometry, we identified preferred proteolytic cleavage next to positively charged and certain, primarily aromatic, non-polar amino acids, while cleavage next to proline, negatively charged, and certain polar residues was disfavored. The proteolytic fingerprint of Lake Geneva was conserved throughout time and water depths and was shared with two other Swiss lakes. In contrast, we observed variability in the types of less prevalent cleavage patterns, suggesting that the degree of heterogeneity in lakewater proteolytic substrate specificity varies spatially and temporally.

The proteolytic fingerprint of Lake Geneva was then used to investigate the structural features determining the stability of the enterovirus echovirus 11 (E11) in lakewater. By linking the lakewater proteolytic fingerprint to E11 structural features, we identified four surface-exposed amino acids on E11 proposed to be susceptible to proteolytic cleavage. The relevance of these amino acids for viral inactivation was tested by producing E11 mutants using reverse genetics and comparing their stability in lakewater relative to that of the E11 wild-type. This revealed that residue VP2.Y97 renders E11 sensitive to proteolytic decay. Strikingly, this residue is absent from several enteroviruses that display greater environmental stability than E11, indicating that substitution at a single capsid position is sufficient to shift virus fate in lakewater.

Finally, we investigated the fate of two enteroviruses, E11 and coxsackievirus B5 (CVB5), and one adenovirus, human adenovirus 2 (HAdV2), in lakewater and explored the mechanisms underlying their microbial inactivation. Combining infectivity assays, genome quantification, and capsid integrity analysis, we identified distinct inactivation rates among these viruses and linked virus decay to differences in capsid structural integrity. We observed rapid, intermediate, and negligible decay for HAdV2, E11, and CVB5, respectively, and confirmed that microbial proteases contribute to their inactivation. In addition, we revealed that loss of capsid structural integrity drives E11 inactivation, but not HAdV2 inactivation, and that genome decay does not correlate with loss of infectivity. These findings have implications for the selection of virus detection method used for evaluating the risks associated with virus transmission.

Les virus entériques constituent une source importante de contamination des eaux de surface et représentent un fardeau considérable pour la santé publique. Comme ces virus ne peuvent se répliquer en dehors de leurs hôtes naturels, leur capacité de se propager dépend en grande partie de leur stabilité environnementale. Dans les écosystèmes aquatiques, les virus entériques sont exposés à une multitude de facteurs de stress abiotiques et biotiques pouvant avoir des effets inactivants ou protecteurs. Ces facteurs causent des répercussions variables selon les types de virus, ce qui entraîne une variabilité dans la stabilité des virus. Les communautés microbiennes aquatiques ont démontré une activité antivirale à travers l'action de protéases sécrétées. Ces enzymes hydrolysent les liaisons peptidiques et induisent l'inactivation des virus par la dégradation de la capside virale. Dans cette thèse, j'ai étudié les mécanismes d'inactivation microbienne des virus entériques dans l'eau de lac, spécifiquement l'activité antivirale des protéases extracellulaires microbiennes.

Nous avons d'abord caractérisé la spécificité de substrat globale des protéases extracellulaires présentes dans le Léman, en Suisse. À l'aide de la technique de profilage multiplex des substrats par spectrométrie de masse (MSP-MS), nous avons identifié une préférence pour les clivages protéolytiques à côté d'acides aminés chargés positivement et de certains acides aminés non polaires, principalement aromatiques. En revanche, les clivages à côté de l’acide aminé proline, d'acides aminés chargés négativement et de certains acides aminés polaires étaient défavorisés. L'empreinte protéolytique du Léman s'est conservée dans le temps et à toutes les profondeurs, et était partagée avec celles deux autres lacs suisses. En revanche, nous avons observé une variabilité dans les types de spécificité de substrat moins fréquents, ce qui suggère que le degré d'hétérogénéité de la spécificité de substrat protéolytique de l'eau des lacs varie dans l'espace et dans le temps.

L'empreinte protéolytique du Léman a ensuite été utilisée pour étudier les caractéristiques structurelles déterminant la stabilité de l'échovirus 11 (E11) dans l'eau du lac. En établissant un lien entre l'empreinte protéolytique du Léman et les caractéristiques structurelles de E11, nous avons identifié quatre acides aminés exposés à la surface de E11 qui seraient susceptibles de subir un clivage protéolytique. La pertinence de ces acides aminés pour l'inactivation virale a été testée en produisant des mutants de E11 par génétique inverse et en comparant leur stabilité dans l'eau du lac à celle de E11 de type naturel. Cela a révélé que l’acide aminé VP2.Y97 rend E11 sensible à la dégradation protéolytique. De plus, cet acide aminé est absent de plusieurs entérovirus qui présentent une plus grande stabilité environnementale que E11, ce qui indique qu'une substitution à une seule position de la capside virale suffit à modifier la persistance des virus dans l'eau de lac.

Enfin, nous avons étudié la stabilité de deux entérovirus, E11 et le virus coxsackie B5 (CVB5), ainsi que d'un adénovirus, l'adénovirus humain 2 (HAdV2), dans l'eau de lac, et avons exploré les mécanismes sous-jacents à leur inactivation microbienne. En combinant des tests d'infectiosité, la quantification génomique et des analyses d’intégrité de la capside, nous avons identifié des taux d'inactivation distincts parmi ces virus et établi un lien entre la dégradation virale et les différences d'intégrité structurelle. Nous avons observé une dégradation rapide, intermédiaire et négligeable pour HAdV2, E11 et CVB5, respectivement, et confirmé que les protéases microbiennes contribuent à leur inactivation. De plus, nous avons révélé que la perte d'intégrité structurelle de la capside explique l'inactivation de E11, mais pas celle de HAdV2, et que la dégradation génomique n'est pas corrélée à la perte d'infectiosité. Ces résultats ont des implications pour le choix de la méthode de détection des virus utilisée pour évaluer les risques associés à la transmission virale.