Dr. Aline Schaub - PhD Defense - January 19, 2024

Abstract
Influenza is an infectious respiratory illness caused by influenza viruses. Every year, it causes up to one billion cases of disease worldwide. Despite its high disease burden, the transmission pathway of influenza remains subject to debate. There is increasing evidence that airborne transmission by exhaled aerosol particles and droplets plays a major role in the spread of the disease, and its study has been declared of primary importance by the World Health Organization. Airborne transmission necessitates that influenza virus remains stable between exhalation by an infected individual and inhalation by the next host, yet its fate in exhaled aerosol particles and droplets is poorly understood. This thesis aims to identify the parameters driving the inactivation of influenza A virus (IAV) in exhaled droplets and aerosol particles, and to quantify the associated inactivation kinetics.
After exhalation, particles and droplets equilibrate with the surrounding air, leading to the loss of water and the partitioning of gases, as well as the enrichment of solutes (salts and various organic compounds). As a result, extreme conditions of pH and salinity can be created within the particles and droplets. We first determined that both acidic pH and high NaCl salinity can inactivate IAV, but that acidic pH is a strong driver of IAV inactivation. We therefore quantified the inactivation kinetics of IAV in simulated lung fluid (SLF) at pH 2.5 to 7, and we combined the inactivation rates with microphysical properties of SLF using a biophysical aerosol model. We found that small aerosol particles (< 1 μm) exhaled into indoor air become mildly acidic (pH≈4), rapidly inactivating IAV within minutes. In contrast, the inactivation of another virus of current concern, SARS- CoV-2, requires days. Aerosol pH can be further decreased by enriching indoor air with non-hazardous levels of nitric acid, allowing inactivation of both viruses in small aerosol particles in less than 30 seconds.
In larger droplets (e.g., 1 μl, corresponding to 1000 μm), acidification is slow and pH-mediated inactivation is inefficient. However, such droplets can reach supersaturated NaCl conditions within minutes. To quantify the effect of NaCl on IAV stability, we exposed IAV in 1-μl saline droplets to different relative humidities and monitored inactivation over time. We demonstrated that IAV inactivation is driven by the increasing NaCl molality during water evaporation, rather than by salt efflorescence, i.e. the precipitation of salt crystals. By combining the experimental results with a biophysical model, we furthermore established an exponential dependence of IAV inactivation rate constants on NaCl molality in the droplets. In the presence of an organic co-solute (sucrose), the inactivating effect of NaCl was attenuated, which we attribute to two mechanisms: first, sucrose decreases the molality of NaCl during the drying phase, and second, sucrose stabilizes IAV by preventing the NaCl-promoted leakage of the lipid bilayer and the unfolding of surface proteins.
Finally, we investigated the effect of additional organic co-solutes beyond sucrose on the stability of airborne IAV. We compared IAV stability in 1-μl droplets consisting of phosphate buffer with that in artificial saliva, SLF and nasal mucus. We found that proteins are the primary protective components in the respiratory fluids, and that the extent of IAV protection increases with increasing protein:NaCl ratio. Protection mechanisms include the triggering of salt efflorescence, which reduces virus exposure to high NaCl molality, and the modulation of the drying droplet morphology. The protective effect of organics was also observed in aerosol particles, but the extent of protection differed between the two systems, indicating that conclusions from droplet studies may not fully apply to aerosol particles.
Overall, this thesis contributes to a better understanding on parameters modulating airborne IAV stability. It emphasizes the role of pH and salinity, as well as the importance of organic content in exhaled aerosol particles and droplets, shedding light on the factors affecting IAV stability and transmission in different fluid matrices. In addition, it provides insights into mitigation strategies to stop the spread of an emerging outbreak.

Keywords: influenza A virus, airborne transmission, aerosol acidity, expiratory droplet, salinity, virus inactivation, respiratory fluid, risk mitigation

Résumé
La grippe est une maladie respiratoire infectieuse causée par un virus, qui provoque chaque année près d’un milliard de cas de maladie dans le monde. Malgré sa virulence, la voie de transmission de la grippe reste sujette à débat. Il est de plus en plus évident que la transmission aérienne par les particules d'aérosols et les gouttelettes exhalées en respirant, en parlant ou en toussant joue un rôle majeur dans la propagation de la maladie, et son étude a été déclarée d'une importance primordiale par l'Organisation Mondiale de la Santé. La transmission par voie aérienne nécessite que le virus de la grippe reste stable entre l'exhalation par un individu infecté et l'inhalation par l'hôte suivant, mais son devenir dans les particules d’aérosols et les gouttelettes exhalées est méconnu. Cette thèse vise à identifier les paramètres qui modulent l'inactivation du virus de la grippe A dans les gouttelettes et les particules d'aérosols exhalées, et à quantifier les cinétiques d'inactivation associées.
Après l'expiration, les particules d’aérosols et les gouttelettes s'équilibrent avec l'air ambiant, ce qui entraîne une perte d'eau et un équilibrage des gaz entre l’air et la particule, ainsi qu'un enrichissement en solutés (sels et divers composés organiques). Par conséquent, des conditions extrêmes de pH et de salinité peuvent être créées à l'intérieur des particules et des gouttelettes. Nous avons tout d'abord déterminé que le pH acide et la salinité élevée de NaCl peuvent tous deux inactiver le virus de la grippe A, mais que le pH acide induit une inactivation plus importante . Nous avons donc quantifié la cinétique d'inactivation du virus dans un liquide pulmonaire simulé (simulated lung fluid – SLF) à des pH de 2.5 à 7, et nous avons combiné les vitesses d'inactivation avec les propriétés microphysiques du SLF à l'aide d'un modèle d'aérosol biophysique. Nous avons constaté que les petites particules d'aérosols (< 1 μm) exhalées dans l'air intérieur deviennent légèrement acides (pH≈4), inactivant rapidement le virus de la grippe A en quelques minutes. En revanche, l'inactivation d'un autre virus préoccupant, le SARS-CoV-2, prend plusieurs jours. Le pH de l'aérosol peut être encore réduit en enrichissant l'air intérieur avec des niveaux non dangereux d'acide nitrique, ce qui permet d'inactiver les deux virus dans de petites particules d'aérosols en moins de 30 secondes.
Dans les gouttelettes plus grosses (par exemple, 1 μl, correspondant à 1000 μm), l'acidification est lente et l'inactivation induite par le pH est inefficace. Cependant, ces gouttelettes peuvent atteindre des conditions de NaCl sursaturé en quelques minutes. Pour quantifier l'effet du NaCl sur la stabilité du virus de la grippe A, nous avons exposé ce dernier dans des gouttelettes salines de 1 μl à différentes humidités relatives et monitoré l'inactivation au fil du temps. Nous avons démontré que l'inactivation du virus est due à l'augmentation de la molalité du NaCl pendant l'évaporation de l'eau, plutôt qu'à l'efflorescence des sels, c'est-à-dire à la précipitation de cristaux de sel. En combinant les résultats expérimentaux avec un modèle biophysique, nous avons en outre établi une dépendance exponentielle des constantes de vitesse d'inactivation du virus par rapport à la molalité du NaCl dans les gouttelettes. En présence d'un co-soluté organique (saccharose), l'effet inactivant du NaCl a été atténué, ce que nous attribuons à deux mécanismes : premièrement, le saccharose diminue la molalité du NaCl pendant la phase d’évaporation, et deuxièmement, le saccharose stabilise le virus en empêchant les dommages à l’enveloppe virale et aux protéines de surface causés par le NaCl.
Enfin, nous avons étudié l'effet de co-solutés organiques supplémentaires, en plus du saccharose, sur la stabilité du virus de la grippe A. Nous avons comparé la stabilité de ce dernier dans des gouttelettes de 1 μl constituées d'une solution tampon avec celle dans de la salive artificielle, du SLF et du mucus nasal. Nous avons constaté que les protéines sont les principaux composants protecteurs dans les fluides respiratoires, et que l'étendue de la protection du virus augmente avec l'augmentation du ratio protéine:NaCl. Les mécanismes de protection comprennent le déclenchement de l'efflorescence saline, qui réduit le temps d’exposition du virus à une molalité élevée de NaCl, et la modulation de la morphologie des gouttelettes. L'effet protecteur des substances organiques a également été observé dans les particules d'aérosols, mais l'étendue de la protection diffère entre les deux systèmes, ce qui indique que les conclusions des études sur les gouttelettes peuvent ne pas s'appliquer entièrement aux particules d'aérosols.
Dans l'ensemble, cette thèse contribue à une meilleure compréhension des paramètres modulant la stabilité du virus de la grippe A transportés par voir aérienne. Elle souligne le rôle du pH et de la salinité, ainsi que l'importance du contenu organique dans les particules d'aérosols et les gouttelettes exhalées, mettant en lumière les facteurs affectant la stabilité et la transmission du virus dans différentes matrices fluides. En outre, elle fournit des indications sur les stratégies visant à stopper la propagation d'une épidémie émergente.

Mots-clés : virus de la grippe A, transmission par voie aérienne, acidité des aérosols, gouttelettes expiratoires, salinité, inactivation du virus, fluide respiratoire, mitigation des risques.