Dr. Simon Meister's PhD defense - June 28th, 2019

Summary
The susceptibility of waterborne viruses to different inactivating treatments is
acknowledged to vary between viruses and even between closely related strains, yet the
extent of this variation, or the underlying mechanisms, are not known. Here, different
enteroviruses (six strains of coxsackievirus B5 (CVB5), two strains of coxsackievirus B4
(CVB4) and one strain of coxackievirus B1 (CVB1)) were isolated from wastewater. The
different viruses were then exposed to disinfectants used in water and wastewater
treatment (UV254, free chlorine (FC), chlorine dioxide (ClO2)) and to stressors encountered in
the environment (sunlight, temperature). Inactivation kinetics of the environmental isolates
were compared with those of laboratory enterovirus strains (CVB5 Faulkner and echovirus
11 Gregory) and MS2 bacteriophage. FC exhibited the greatest variability in inactivation
kinetics between different strains, whereas inactivation by UV254 differed only subtly. The
variability in inactivation kinetics was greater between serotypes than it was among the
seven strains of the CVB5 serotype. MS2 was a conservative surrogate of enterovirus
inactivation by UV254, sunlight or heat, but frequently underestimated the disinfection
requirements for FC and ClO2.
To assess the mechanisms underlying the differing susceptibilities of these viruses to
inactivation, we focused on thermal inactivation. Specifically, we extensively analyzed the
inactivation of these viruses at 30 and 55°C, and under different conditions of pH and NaCl
concentrations. At 30°C, inactivation at neutral pH was slow, but both acidic and alkaline pH
enhanced inactivation, and the addition of 1 M NaCl exerted a synergistic inactivating effect.
These findings are consistent with RNA cleavage being the main mechanism of inactivation,
and genome degradation was experimentally confirmed. At 55°C, salt had a protective effect
on all viruses. This was rationalized by calculations of the different protein interaction
forces, which demonstrated that increasing concentrations of salt resulted in increasing
attractive forces at the capsid pentamer interfaces. At this temperature, major differences in
thermoresistance between the viruses were observed, with CVB4 and E11 displaying the
lowest thermoresistance, and the CVB5 laboratory strain being less thermoresistant than
the CVB5 isolates. These differences could not be explained by a shift in capsid pentamer
interaction forces, but likely resulted from mutations located in VP1 pocket region.
The importance of the VP1 pocket region was further confirmed by adapting CVB5 to two
different temperatures (50 and 55 °C). The thermo-adapted strains exhibited a competitive
fitness trade-off compared to control strains, but were significantly more resistant to
thermal inactivation. This resistance coincided with the appearance of one or several of four
mutations in the VP1 region of the structural proteins. These mutations did not affect the
interaction forces at the pentamer interface. Instead, they were located in the VP1 pocket
region, confirming the importance of this region in the acquisition of thermotolerance.
Overall, these data indicate that the thermostability of a virus can be enhanced by external
(matrix) factors, in particular salinity, or by intrinsic (structural) modifications in the VP1
pocket region.
Keywords: virus, water, disinfection, resistance, temperature

Résumé
La sensibilité à différents traitements d’inactivation est connue pour varier entre les virus, et
même entre les des souches de virus apparentés. Cependant, l’étendue de cette variation,
ainsi que les mécanismes responsables de celle-ci n’est pas connus. Dans cette étude,
différent entérovirus (six souches the coxsackievirus B5 (CVB5), deux de coxsackievirus B4
(CVB4), et une souche de coxsackievirus B1 (CVB1)) ont été isolées d’eau usée, et soumises à
plusieurs traitements de désinfection (UV254, le chlore libre, et le dioxide de chlorine) et
autres facteurs de stress rencontrés dans l’environnement (soleil, temperature). Les
cinétiques d’inactivation des souches environnementales ont été comparées avec les
souches de laboratoire (CVB5 Faulkner et échovirus 11 Gregory) ainsi qu’avec le
bactériophage MS2. La plus grande variabilité entre les souches a pu être observée avec le
traitement au chlore libre, contrairement au traitement à l’UV254, qui ne présentait
seulement qu’une variabilité subtile. La cinétique d’inactivation entre les différents
sérotypes apparaissait plus grande que celle observée au sein du sérotype CVB5. Quant à
MS2, il apparaît comme un substitut conservatif pour l’inactivation des enterovirus à l’UV254,
au soleil, ainsi qu’à la température, mais sous-estime la désinfection au chlore libre et au
dioxide de chlorine.
Pour évaluer les mécanismes responsable de ces différences à l’inactivation de ces virus, le
choix s’est porté sur la température. Plus précisément, nous avons analysé l’inactivation de
ces virus à deux températures, 30 et 55°C, ainsi qu’à deux différentes conditions de pH et
concentration de sel (NaCl). A 30°C, une lente inactivation a pu être constatée à pH neutre,
et plus rapide à pH acide ou alcalin. De plus, l’ajout de 1M de NaCl a provoqué une forte
augmentation de l’inactivation observée à ces pH extrêmes, de façon synergétique. Ces
résultats apparaissent cohérents avec un clivage de l’ARN, confirmé expérimentalement par
une dégradation de l’ARN viral. À 55°C, un effet protecteur du sel a pu être constaté sur tous
les virus étudiés, ce qui a pu être justifié par une augmentation des forces d’attraction à
l’interface des structures pentamériques constituant la capside virale. À cette température,
des différences importantes entre les souches virales ont été constatées, les souches CVB4
et échovirus 11 étant plus thermosensibles que toutes les autres, et la souche de laboratoire
CVB5 étant plus thermosensible que ses isolats environnementaux correspondants. Ces
variations n’ont pas pu être expliquées par un changement dans les forces d’interaction des
pentamères, mais pourraient être possiblement provoquées par des mutations localisées
dans la poche hydrophobe de VP1.
L’importance de cette poche a pu être confirmée en adaptant CVB5 à deux températures, 50
et 55°C. Les souches adaptées sont apparues moins compétitives que les souches contrôles,
mais était plus résistantes à la température. Cette résistance coïncide avec l’apparition de
mutations dans cette même poche hydrophobe, mais n’impliquant aucun changement dans
les forces d’interaction des pentamères. Ces résultats confirment l’importance de cette
poche hydrophobe dans la résistance des virus à la température.
Globalement, ces données nous révèlent que la thermo-résistance des virus peut être
renforcée par des facteurs externes, comme la salinité, ou par des modification structurales
de la poche hydrophobe de VP1.
Mots-clés: virus, eau, désinfection, résistance, température