Dr. Odile Hervas de Nalda Larivé's PhD defense - December 2nd, 2022

Abstract

Enteroviruses are ubiquitous surface water contaminants, where they can persist for long periods of time and can pose a threat to human health. Enterovirus genotypes display variability in their sensitivity to natural stressors, and the persistence of enteroviruses in the environment will thus depend on the genotypes present and the stressors encountered. Enteroviruses are discharged into the environment through treated sewage, and their composition depends on the genotypes circulating as well as their persistence through the sewage treatment. This thesis aims to evaluate how a population of enteroviruses is shaped by sewage treatment prior to environmental discharge, and to evaluate the diversity of responses among genotypes when exposed to Lake Geneva.

The main reason for the lack of knowledge about the diversity of responses to stressors among enterovirus genotypes is the absence of methods allowing for infectivity measurements of several enterovirus types in a mixed sample. Firstly, we developed an integrated cell culture reverse transcriptase quantitative PCR (ICC-RTqPCR) method to simultaneously and specifically quantify the infectious concentrations of eight enterovirus genotypes commonly encountered in sewage: coxsackieviruses A9, B1, B2, B3, B4 and B5, and echoviruses 25 and 30. The outcome of this method was calibration curves for the eight genotypes allowing the infectious concentration of each genotype to be inferred based on the increase in qPCR signal after amplification on cells. The method was able to accurately quantify the infectious concentration of a virus after inactivation by heat, and the concentration of a virus within a wastewater matrix.

The method developed was then used to evaluate how activated sludge and chlorination treatment shaped the population of interest at the genotype level. We found that the extent of inactivation by activated sludge varied greatly among genotypes, but also among sludge samples. Overall, our results suggest that activated sludge effluent will be depleted in CVA9 and CVB1 while E25 will persist. Our data also show that inactivation of enteroviruses in the sludge is predominately due to microbial activity, and to a lesser extent to chemical inactivation. Chlorination also caused a wide range of inactivation rates among genotypes, with CVB5 and CVB3 being the least susceptible and E30 being the most. E25 and CVB5 were found to gain protection against chlorination from exposure to activated sludge-derived EPS.

Finally, the ICC-RTqPCR method developed was used to evaluate the diversity in decay in Lake Geneva among our population of eight enteroviruses. An environmental chamber was used to expose the enteroviruses to Lake Geneva for five days during winter and spring. A wide range of inactivation among genotypes was found during both seasons, but the relative sensitivity of the genotypes differed between seasons. Inactivation was globally greater at higher temperatures, though the inactivation and its variation at different temperatures was not very large, with a maximal inactivation of 2.3 log₁₀ and most genotypes being inactivated by 1 log₁₀ or less over five days. Furthermore, inactivation was found to be microbially mediated both in spring and in winter.

Overall, this thesis contributes to a better understanding of the variability of responses to sewage treatment and environmental exposure that exists among a population of enteroviruses. It highlights particularly persistent genotypes, and shows the importance of considering the diversity that exists among enterovirus genotypes when predicting the effect of an inactivating treatment or environmentally-associated stressor.

Résumé

Les entérovirus sont des contaminants omniprésents dans les eaux de surface, où ils peuvent persister pendant de longues périodes et constituer une menace pour la santé humaine. Les génotypes d'entérovirus présentent une variabilité dans leur sensibilité aux facteurs de stress naturels, et la persistance des entérovirus dans l'environnement dépendra donc des génotypes présents et des facteurs de stress rencontrés. Les entérovirus sont rejetés dans l'environnement via les eaux usées traitées, et leur composition dépendra des génotypes en circulation ainsi que de leur persistance à travers le traitement des eaux usées. Cette thèse vise à évaluer comment une population d'entérovirus est façonnée par le traitement des eaux usées avant son rejet dans l'environnement, ainsi que la diversité des réponses parmi les génotypes lorsqu'ils sont exposés à l’environnement du lac Léman.

La principale raison du manque de connaissances sur la diversité des réponses aux facteurs de stress parmi les génotypes d'entérovirus est l'absence de méthode permettant de mesurer l'infectiosité de plusieurs types d'entérovirus dans un échantillon mixte. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode de transcriptase inverse-PCR quantitative combinée à une culture cellulaire (ICC-RTqPCR) pour quantifier simultanément et spécifiquement les concentrations infectieuses de huit génotypes d'entérovirus couramment rencontrés dans les eaux usées : les coxsackievirus A9, B1, B2, B3, B4 et B5, et les échovirus 25 et 30. Le résultat de cette méthode s’est materialisé par des courbes d'étalonnage pour les huit génotypes permettant de déduire la concentration infectieuse de chaque génotype en fonction de l'augmentation du signal qPCR, après amplification sur les cellules. La méthode a permis de quantifier avec précision la concentration infectieuse résiduelle d'un virus après inactivation par la chaleur, et la concentration d'un virus dans une matrice d'eaux usées.

La méthode développée a ensuite été utilisée pour évaluer comment les boues activées et le traitement par chloration façonnaient la population d'intérêt au niveau du génotype. Nous avons constaté que l'étendue de l'inactivation par les boues activées variait considérablement entre les génotypes, mais aussi entre les échantillons de boues. Globalement, nos résultats suggèrent que les effluents de boues activées seront appauvris en CVA9 et CVB1 alors que E25 persistera. Ils montrent également que l'inactivation des entérovirus dans les boues est due à l'activité microbienne, et dans une moindre mesure à l'inactivation chimique. La chloration a également provoqué un large éventail d'inactivations parmi les génotypes, CVB5 et CVB3 étant les moins sensibles et E30 le plus affecté. Il a été constaté que E25 et CVB5 obtenaient une protection contre la chloration due à l'exposition à des substances polymériques extracellulaires dérivées de boues activées.

Enfin, la méthode ICC-RTqPCR développée a été utilisée pour évaluer la diversité d’inactivations dans le lac Léman parmi notre population de huit entérovirus. Une chambre environnementale a été utilisée pour exposer les entérovirus au lac Léman pendant cinq jours en hiver et en été. Une large gamme d'inactivations parmi les génotypes a été observée au cours des deux saisons, mais la sensibilité relative des génotypes différait d'une saison à l'autre. L'inactivation était globalement plus élevée à des températures plus hautes, bien que l'inactivation et sa variation à différentes températures ne soient pas très importantes, avec une inactivation maximale de 2,3 log₁₀, la plupart des génotypes étant inactivés de 1 log₁₀ ou moins sur cinq jours. De plus, l'inactivation s'est avérée être due à l’activité microbienne à la fois en été et en hiver.

Globalement, cette thèse contribue à une meilleure compréhension de la variabilité des réponses au traitement des eaux usées et à l'exposition environnementale qui existe au sein d'une population d'entérovirus. Elle met en évidence certains des génotypes qui ont le mieux ou le moins bien résisté aux différents facteurs de stress évalués et montre l'importance de considérer la diversité existant parmi les génotypes d'entérovirus pour prédire l'effet qu'un traitement ou une exposition à l'environnement aura sur les entérovirus.